Diagnostics moléculaires pour la détection et la caractérisation des pathogènes microbiens

Des méthodes nouvelles et avancées de diagnostic moléculaire modifient la façon dont nous pratiquons la microbiologie clinique qui affecte la pratique de la médecine L’amplification du signal et les technologies d’amplification des acides nucléiques en temps réel offrent un résultat sensible et spécifique avec un délai d’exécution plus rapide que jamais De nombreuses méthodes d’analyse postamplification permettent la détection et la différenciation simultanées de nombreux pathogènes microbiens, leurs mécanismes de résistance et la construction de tests spécifiques à la maladie. La faisabilité technique de ces tests a déjà été démontrée Comment ces nouveaux tests, souvent plus coûteux, seront incorporés dans la pratique de routine et l’impact qu’ils auront sur les soins aux patients reste à déterminer L’une des utilisations les plus attrayantes de ces techniques consiste à caractériser plus rapidement l’agent infectieux, de sorte qu’un agent antimicrobien à spectre plus étroit puisse être utilisé, avoir un impact sur les profils de résistance

Il a été & gt; des décennies depuis la création de la PCR Bien que cette technique ait été presque immédiatement appliquée dans des laboratoires de recherche pour étudier diverses maladies infectieuses, entre autres, ce n’est que depuis quelques années que ces tests ont été En plus de la PCR, de nombreuses technologies compétitives ont été développées et se sont avérées utiles pour la détection et la caractérisation de micro-organismes. Beaucoup de ces tests plus récents peuvent être réalisés par des laboratoires médicaux. technologues qui, bien que hautement qualifiés, ne possèdent pas de formation avancée en biologie moléculaire La simplification de ce type de test signifie qu’il peut être effectué après des heures ou dans des conditions défavorables, c’est-à-dire sur le terrain. ou défriché, et plus sont dans ce processus Aujourd’hui, dans le laboratoire de microbiologie moderne, il y a vraiment un “moléculaire révolution en cours Bien que ce soit excitant, la responsabilité du laboratoire et du médecin ordonnateur est de s’assurer que ces tests sont utilisés de manière appropriée. L’abus de cette technologie a de sérieuses implications pour le coût et les soins, car, comme pour tout test, Des réactions faussement positives et faussement négatives peuvent survenir. On demande parfois au microbiologiste clinique d’exclure la présence d’un microorganisme particulier dans un échantillon clinique. Par exemple, le LCR peut être soumis à l’exclusion du virus de l’herpès simplex ou un frottis sanguin peut être soumis. l’exclusion des espèces de Plasmodium Cependant, dans plusieurs cas, plusieurs tests sont ordonnés par échantillon clinique, et les questions posées sont de nature plus large. Par exemple, quand une culture de sang ou de plaie est ordonnée, la question est vraiment: Y a-t-il des bactéries? champignons présents dans cet échantillon clinique, et à quels agents antimicrobiens sont-ils sensibles? Le clinicien prélève rarement un échantillon de sang pour la culture pour la détection ou l’exclusion d’un seul type de micro-organisme, c’est-à-dire que le sang n’est pas prélevé pour exclure la culture de Pseudomonas, mais plutôt pour déterminer s’il y a bactériémie ou fongémie. La tâche du microbiologiste clinique est compliqué, car il doit être conscient de tous les pathogènes potentiels qui peuvent être présents dans un échantillon clinique et doit concevoir ou utiliser des moyens permettant de détecter et de caractériser ces organismes. Les techniques de diagnostic moléculaire utilisées pour la détection et la caractérisation des microorganismes peuvent être Ces méthodes peuvent être utilisées pour détecter ou exclure des agents pathogènes particuliers ou, plus utilement, pour évaluer un spécimen ou un échantillon de culture positif sur une large échelle. variété de micro-organismes La valeur de telles applications doit être rigoureusement évaluée, car ces tests sont généralement ajoutés à la batterie de routinel Les tests sont moins susceptibles d’être trouvés en laboratoire et plus susceptibles d’être vus par le clinicien ou l’administrateur des soins de santé. Par exemple, la détection et la caractérisation plus rapides d’un pathogène infectieux permettent au clinicien de En plus de profiter aux patients, cela pourrait faire économiser de l’argent aux soins de santé en identifiant des situations où des agents antimicrobiens moins coûteux pourraient être utilisés. Par exemple, Forrest et al ont démontré que les coûts en pharmacie par patient pouvaient Le recours à des agents à spectre plus étroit, contrairement à l’utilisation d’agents à large spectre, devrait également ralentir la sélection et la propagation de micro-organismes résistants aux antimicrobiens. les avantages qui ont été notés comprennent une meilleure utilisation des tests diagnostiques auxiliaires, par exemple, les services de radiologie et de lits d’hôpitaux c’est-à-dire, la diminution des durées de séjour ou le nombre d’admissions inutiles

Hybridation directe

Les mêmes sondes d’hybridation utilisées dans le laboratoire de microbiologie clinique pourraient être utilisées dans des réactions d’hybridation in situ dans des coupes histologiques Hayden et al. ont démontré, dans des études histologiques, la présence de trypanosomes chez des patients atteints de maladie du sommeil africaine. une série d’articles [, -], que l’hybridation chromogénique in situ peut être utilisée avec succès pour différencier des microorganismes morphologiquement similaires Ils ont montré la faisabilité de cette technologie pour détecter Legionella pneumophila et différencier les bactéries filamenteuses, actinomyces aérobies, champignons filamenteux et levures et levures Ils ont montré la capacité de séparer les champignons dimorphes systémiques, qui apparaissent en levure, par exemple, Histoplasma capsulatum et Blastomyces dermatitidis ou des sphérules, par exemple, Coccidioides immitis, des espèces Candida et Cryptococcus. Bien que cela puisse sembler une tâche morphologiquement simple de différencier un puits. sphérule développée de C immitis de buddi La levure est beaucoup plus compliquée quand on ne voit pas de sphérules intactes et que seules des sphérules et des endospores immatures sont présentes. L’hybridation in situ a également été utilisée pour identifier Pneumocystis jiroveci Enfin, on peut imaginer un bénéfice économique quand la même sonde Par exemple, les sondes PNA FISH ont également été utilisées avec succès pour identifier des mycobactéries dans des coupes histologiques et à partir d’échantillons de cultures positives Une autre application intéressante pouvant avoir des applications pratiques dans le laboratoire de microbiologie clinique est la Utilisation combinée de l’hybridation in situ et de la cytométrie de flux Des cytomètres de flux à petite échelle capables de détecter les microorganismes ont été développés et sont couramment utilisés dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique Ces applications utilisent souvent des colorants non spécifiques qui se lient à l’extérieur des bactéries. utile pour déterminer les comptes bactériens globaux dans un produ Cependant, il a été démontré que cette technologie peut être utilisée pour détecter les micro-organismes auxquels des sondes in situ sont hybridées Cette combinaison de technologies permet le remplacement de l’interprétation humaine. , qui est subjective et nécessite une formation et une expérience avancées pour parfaire, avec des mesures quantitatives objectives qui sont effectuées par un instrument. Le rôle précis que l’hybridation in situ va jouer dans le laboratoire de microbiologie clinique et son impact sur les soins restent à voir. Les technologies, dont certaines sont décrites ci-dessous, offrent des avantages similaires en ce qui concerne l’identification rapide. Néanmoins, il a été démontré que l’identification des microorganismes les plus courants responsables de bactériémie et de fongémie peut être rapidement déterminée par cette technologie. sont plusieurs autres méthodes d’amplification du signal La technologie d’hybridation de sondes ARNr chimioluminescentes qui est disponible chez GenProbe depuis des années pourrait être étendue / promue pour détecter un grand nombre de ces agents pathogènes. Cette technologie utilise des sondes qui ciblent l’ARNr, qui sont utilisées dans de nombreux laboratoires de microbiologie clinique. est présente dans de nombreuses copies dans chaque cellule La sonde hybridée est ensuite détectée à l’aide d’une réaction chimique exclusive qui produit de la lumière. Les produits qui utilisent cette technologie sont utilisés depuis de nombreuses années dans de nombreux laboratoires pour identifier rapidement les mycobactéries les plus courantes. Pour les isolats suspectés de représenter les champignons dimorphes systémiques [-,, -] Bien que des produits aient été développés pour la détection rapide de nombreuses bactéries plus courantes, telles que S aureus, elles n’ont pas été largement adoptées pour l’identification rapide des causes communes de bactériémie et de fongémie [,,] Il y a cependant eu quelques des indices que cette entreprise pourrait être intéressée par le développement de panels utiles pour l’identification des bactéries et levures les plus couramment rencontrées, bien qu’un produit commercial ne soit pas disponible. La technologie de capture hybride Digene, qui a été utilisée avec succès pour la détection de HPV à haut risque. sous-types, est également une technologie d’amplification de signal Cette technologie a également été utilisée pour la détection de cytomegalovirus, virus de l’hépatite B, Neisseria gonorrhoeae et Chlamydia trachomatis Bien que les tests d’amplification de signal n’utilisent pas la microscopie directe. Comme l’amplification de l’acide nucléique, certains ont montré le contraire Ces tests ont une sensibilité adéquate pour de nombreuses applications cliniques et offrent une haute spécificité, selon la spécificité des sondes utilisées. En plus des types d’applications décrites, cette technologie pourrait également être utilisée. pour caractériser les bactéries ou les champignons qui poussent dans la culture et nécessitent des identi fication

Amplification d’acide nucléique

L’histoire de l’utilisation de la PCR dans les laboratoires cliniques confirme cette notion Bien que la PCR et d’autres technologies d’amplification de l’acide nucléique notent: ci-après, la «PCR» sera utilisée génériquement pour englober toutes les méthodes d’amplification d’acide nucléique ont pénétré dans les plus grands laboratoires diagnostiques et universitaires pour la détection de microorganismes qui sont généralement difficiles à cultiver, ils sont récemment devenus facilement disponibles dans de petits laboratoires, peut-être moins moléculaire La PCR traditionnelle est lourde et lente, surtout à la lumière du temps et du processus nécessaires pour déterminer spécifiquement la nature du produit amplifié par analyse par transfert de Southern. Cependant, tout cela a changé avec l’avènement de la PCR en temps réel, également connu sous le nom “d’amplification rapide et homogène d’acide nucléique” L’avènement de la PCR en temps réel attendait Les ingénieurs ont conçu des moyens de réduire le temps de cycle de la PCR. Ceci a été accompli en utilisant de l’air chauffé et refroidi pour obtenir un chauffage et un refroidissement plus rapides, respectivement. Ceci contraste avec le chauffage traditionnel par blocs, dans lequel, traditionnellement, un bloc métallique ou solide a été chauffé et refroidi pour modifier les températures des cuves de réaction contenues dans le bloc pour atteindre les températures nécessaires à la PCR. Cette dernière méthode, bien qu’efficace, est naturellement plus lente et reflète les différences physiques entre chauffage par conduction et convection. , les ingénieurs ont dû développer des systèmes optiques suffisants pour ces instruments, à la fois introduire un faisceau de lumière d’une longueur d’onde particulière et détecter les changements minimes de la lumière émise par la solution dans le réacteur. Heureusement, beaucoup de ces problèmes techniques ont été résolus qui a utilisé la technologie laser et colorant fluorescent pour diverses applica Les progrès de la chimie qui ont rendu possible la PCR en temps réel étaient également significatifs, et les modifications de ces réactions chimiques se poursuivent aujourd’hui. Le défi consistait à concevoir un moyen d’amplification. et des réactions de détection peuvent survenir dans le même récipient de réaction sans nécessiter l’ouverture du vaisseau et la manipulation du produit amplifié. Maintenir un système fermé est important dans un laboratoire de microbiologie clinique, car une contamination chimique de l’environnement par un amplicon pourrait conduire à des résultats faussement positifs. réactions Ceci a été réalisé par la découverte et la construction de molécules non fluorescentes dans un état non hybride mais capables de générer un signal fluorescent quand elles sont toutes deux liées à leur cible d’ADN et excitées par l’énergie électromagnétique appropriée. seulement la présence d’ADN double brin c’est-à-dire la preuve que la PCR est survenue, ou spécifique, qui est réalisée par l’hybridation de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence spécifiques. Un exemple de sonde non spécifique est le colorant SYBR Green qui se lie à la rainure mineure de l’ADN double brin. dérivé de cette molécule, alors que la PCR est en cours, démontre ainsi en temps réel à l’utilisateur qu’une amplification est en cours. On ne peut pas déterminer cette amplification à ce stade de la réaction. Voir l’analyse de la courbe de fusion ci-dessous. sonde oligonucléotidique spécifique marquée par fluorescence, puis le signal détecté pendant la PCR est la preuve que la molécule d’ADN cible est présente, car la sonde oligonucléotidique s’hybride à sa cible par des règles d’appariement de bases Watson et Crick spécifiques Il existe plusieurs types d’oligonucléotides sondes disponibles Les types les plus couramment utilisés sont les sondes d’hydrolyse ou «TaqMan», les balises moléculaires et la fluorescence. Sondes FRET de transfert d’énergie par résonance Un résultat de PCR en temps réel positif pour l’une de ces sondes est démontré par une augmentation exponentielle de la fluorescence par rapport au temps d’amplification ou au nombre de cycles. Les échantillons qui ne contiennent pas la molécule cible ou pas de changement de fluorescence L’information qualitative dérivée de telles réactions est utile pour démontrer la présence ou l’absence d’un micro-organisme d’intérêt. Par exemple, des dosages ont été conçus pour traiter la présence ou l’absence de Legionella pneumophila par PCR en temps réel. le test peut offrir des temps de résultats similaires à ceux de la détection directe d’antigènes par immunofluorescence, mais il a été démontré que la PCR en temps réel était plus sensible que la détection directe par antigène d’immunofluorescence; de plus, le même test a été décrit comme étant plus rapide et peut-être plus sensible que la culture tout en conservant une spécificité équivalente à celle de la culture

Figure Vue largeDownload slideExemples de réactions d’amplification PCR en temps réel L’échantillon témoin négatif a produit une ligne plate, tandis que le témoin positif et les autres échantillons contenant un modèle montrent une augmentation exponentielle de la fluorescence. point, ou nombre de cycles seuil [Ct] contiennent une plus grande quantité de modèle cible que ceux qui sont devenus positifs plus tardFigure View largeDownload slideExemples de réactions d’amplification PCR en temps réel Le spécimen de contrôle négatif a produit une ligne plate, tandis que le contrôle positif et autre Les réactions qui deviennent positives plus tôt, c’est-à-dire qui ont un point de croisement inférieur ou un nombre de cycles [Ct] contiennent une plus grande quantité de matrice cible que celles devenues positives plus tard. La spécificité d’un test de PCR est déterminée par la séquence d’ADN cible en cours d’évaluation, la La plupart des dosages sont spécifiques aux espèces, mais des essais génériques-génériques, c.-à-d. une PCR à plus large spectre, peuvent également être conçus. Il est important de détecter tous les membres d’un groupe qui peuvent être de nature divergente. Par exemple, on peut utiliser une PCR spécifique à l’espèce pour Salmonella sérotype Typhi, pour détecter ce sérotype particulier, ou un test Salmonella à large spectre, pour détecter tous les les membres de ce genre En plus de la détection d’agents pathogènes microbiens, ces applications peuvent être utilisées pour détecter des éléments génétiques qui codent pour des mécanismes de résistance antimicrobienne, par exemple le gène mecA, ceux qui déterminent les sous-types de ces gènes à des fins épidémiologiques. la cassette mecA IV associée à l’infection de Staphylococcus aureus acquise dans la communauté, et la détection de facteurs de virulence, par exemple, la leucocidine de Panton-Valentine Bien qu’utile pour la détection de c. ertains mécanismes de résistance, des tests d’amplification d’acide nucléique pour des mécanismes de résistance aux antimicrobiens plus compliqués et génétiquement diversifiés, par exemple, les β-lactamases à spectre étendu sont restées insaisissables et ne remplaceront probablement pas les tests de susceptibilité phénotypiques traditionnels dans un proche avenir

Analyse post-amplification

Analyse de la courbe de fusion Une autre caractéristique de certaines des réactions chimiques utilisées avec la PCR en temps réel est la possibilité d’effectuer une analyse de la courbe de fusion postamplification. Cette information fournit des informations différentes selon le type de sonde utilisé. Les amplicons plus grands sont maintenus ensemble par plus de liaisons hydrogène, tandis que les plus petits amplicons, tels que les dimères amorces, sont maintenus ensemble par moins de liaisons hydrogène La courbe de fusion postamplification dérivée en utilisant ces types de Certains chercheurs ont démontré la détection et la différenciation de SNP polymorphismes mononucléotidiques en utilisant des courbes de fusion à haute résolution et des colorants de liaison à l’ADN non spécifiques. , mais, pour la plupart, ces utilisations restent expérimentales Le problème FRET es et une autre sonde oligonucléotidique appelée sonde Eclipse sont les types de sondes oligonucléotidiques spécifiques qui fournissent les meilleures courbes de fusion postamplification. Avant tout, une analyse de la courbe de fusion après amplification fournit des informations sur la spécificité de la réaction. Une température de fusion particulière est attendue pour l’hybridation. sonde oligonucléotidique et sa cible La présence de la courbe de fusion attendue après amplification permet d’assurer à l’utilisateur que les résultats sont corrects Si, par exemple, les amorces étaient dégénérées et amplifiait également un microorganisme apparenté, la courbe de fusion engendrée aurait une température inférieure à attendu que si des polymorphismes nucléotidiques existaient sur le site d’hybridation de la sonde Cette erreur d’identification moléculaire ne serait pas détectée dans le mode “quantification” de l’instrument, et si un tel scénario se produisait, l’échantillon serait considéré comme positif. effectué, puis le nuc les mésappariements de leotides entre la sonde et les séquences cibles seraient détectés, car la sonde ne pourrait pas s’hybrider à sa séquence cible avec l’affinité optimale et «fondrait» à une température plus basse Cette technologie est si sensible qu’elle est couramment utilisée pour déterminer les SNP dans Par conséquent, l’analyse de la courbe de fusion postamplification est une méthode qui permet d’obtenir des données supplémentaires sur la nature spécifique du produit d’ADN amplifié après PCR en temps réel. Cette différence dans les courbes de fonte créées par un défaut imparfait. la complémentarité entre les sondes et leurs sites d’hybridation cibles peut être exploitée pour différencier les microorganismes apparentés taxonomiquement au niveau de l’espèce. Les tests ont été conçus pour différencier le type HSV et les polyomesomes BK et JC, les herpesvirus humains types A et B, les espèces Bartonella courantes, et M tuberculose de la figure des mycobactéries non tuberculeuses, entre autres La plication est très utile, mais il existe des preuves que la sensibilité de la cible qui a la température de fusion la plus basse est faible, c’est-à-dire la complémentarité imparfaite. Il serait donc prudent de ne pas utiliser ce type d’application. ce profil provoquait une maladie grave, c’est-à-dire s’il y avait une séquelle significative associée à une réaction faussement négative ou si un tel organisme cible est présent en petites quantités et peut être manqué à cause de la sensibilité limitée. L’approche que nous avons prise avec les mycobactéries utilisé cette technologie pour différencier les mycobactéries qui sont détectées dans le frottis acido-résistant ou dans les coupes histologiques colorées par la méthode de Ziehl-Neelsen. Dans ce cas, il ne s’agit pas de “si” les mycobactéries sont présentes, mais plutôt une question de “quel type de” mycobactéries est présent, avec pour objectif principal la séparation de M tuberculosis de la figure mycobactérienne non tuberculeuse Les sondes de suture ont% d’homologie avec M tuberculosis, les mycobactéries non tuberculeuses ayant un mésappariement ⩾-nt au site d’hybridation de la sonde. Cette conception rend le test le plus sensible pour la détection des mycobactéries les plus importantes que l’on rencontre en microbiologie nord-américaine. On observe des bacilles acido-résistants dans les frottis ou les tissus colorés, mais le produit amplifié n’est pas détecté, alors on peut classer le résultat en «quantité de mycobactéries inférieure à la limite de détection de ce test», ce qui est un résultat plus utile qu’un résultat faux négatif

Figure Vue largeDownload slidePostamplification courbes de fusion générées après une large gamme PCR pour mycobactéries extraits d’ADN de Mycobacterium tuberculosis TB et mycobactéries non tuberculeuses NTM sont utilisés comme contrôles La courbe de fusion dérivé d’un spécimen contenant des mycobactéries est clairement catégorisée ici comme NTM, ce qui signifie que le Patient ne nécessite pas d’isolement respiratoire ou de thérapie antituberculeuseFigure vue largeTélécharger diapositivePostamplification des courbes de fusion générées après une large gamme de PCR pour mycobactéries Des extraits d’ADN de Mycobacterium tuberculosis TB et des mycobactéries non tuberculeuses NTM sont utilisés comme témoins La courbe de fusion dérivée d’un spécimen contenant des mycobactéries est clairement catégorisée ici comme NTM, ce qui signifie que le patient ne nécessite pas d’isolement respiratoire ou de thérapie antituberculeuseIl existe une variété d’autres méthodes d’analyse d’amplicon postamplification qui nécessitent l’ouverture et la manipulation de produit de PCR amplifié. Ce sont des méthodes acceptables, mais il faut veiller à éviter l’introduction de produits amplifiés dans les domaines de la préparation du mélange maître ou de la préparation des échantillons, pour éviter les réactions faussement positives. Les types de méthodes sont trop nombreux pour être décrits de façon exhaustive dans cet article. quelques-uns soulignent que cela a ou aura probablement un impact en médecine clinique; ce sont l’hybridation inverse, le séquençage de l’ADN – y compris le pyroséquençage – et l’analyse des puces à ADN, en mettant l’accent sur les puces à ADN limitées des formats solide et liquide. Il est souvent nécessaire d’évaluer ou d’identifier & gt; agent pathogène microbien Il est plus économique et plus rentable de réaliser ces évaluations simultanément ou en une seule réaction que si elles sont réalisées dans de nombreuses réactions d’amplification du monoplex. Par exemple, il est nécessaire de doser de nombreux HPV à haut risque pour diagnostiquer correctement ou exclure une infection à HPV à haut risque chez une femme. Il est préférable d’effectuer un seul test pour détecter et / ou différencier ces virus plutôt que de réaliser un & gt; PCR individuelles pour les différents sous-types HPV à haut risque Les analyses postamplification sont souvent utilisées lorsque le nombre de résultats obtenus dépasse les capacités de différenciation technique des réactions multiplex dans lesquelles chaque réaction contient un marqueur fluorescent différent ou lorsque le nombre de résultats obtenus dépasse les capacités de différenciation Analyse de la courbe de fusion L’hybridation inverse L’une des méthodes les plus simples pour détecter une variété de pathogènes, après une réaction d’amplification multiplex ou à large spectre, est l’hybridation inverse. Cette technique est l’inverse de l’analyse par transfert de Southern dans de nombreux cas. Dans ce cas, une variété de sondes sont placées sur une bande de membrane de nitrocellulose, et l’amplicon plutôt que la sonde est marqué. L’amplicon est appliqué à la bande dans des conditions d’hybridation appropriées, puis des étapes de lavage sont effectuées. l’amplicon s’hybride à l’une des sondes immobilisées, il peut b La position du produit sur la bande révèle la nature de l’agent pathogène Cette technologie a été utilisée pour détecter et différencier les mycobactéries courantes, les champignons cliniquement importants, les sous-types de VPH, les génotypes du virus de l’hépatite C et certaines mutations associées à la résistance au VIH Cette technologie est simple à utiliser, mais certaines applications ont été limitées en raison du coût du produit. Occasionnellement, des bandes lumineuses d’hybridation non spécifique sont vues, des «bandes fantômes» pouvant confondre interprétation ou suggérer des infections doubles

e utilisé pour différencier la majorité des mycobactéries cliniquement rencontrées Ici, tous les sites d’hybridation sont développés Les seules lignées qui seraient présentes si un spécimen clinique ou un échantillon de culture positif était testé et qui contenait une seule espèce de mycobactéries seraient les lignées correspondant aux espèces, le genre Mycobacterium et la position de contrôle du conjugué. Les abréviations sur le côté gauche de la bande d’hybridation inverse sont en corrélation avec les espèces ou groupes sur le côté droit de la bande MAIS, Mycobacterium avium-M intracellulare-M scrofulaceum; Séquençage MTB, M tuberculosisADN: Sanger traditionnel et pyroséquençage Le séquençage de l’amplicon, par séquençage Sanger traditionnel, est l’analyse ultime de postamplification. La composition entière du produit amplifié est ainsi déterminée. Bien qu’initialement difficile à réaliser, cette technologie est maintenant facilement disponible pour Les progrès de l’électrophorèse capillaire et en gel, ainsi que l’analyse de séquence assistée par ordinateur, permettent une utilisation élargie de cette technologie à bien d’autres laboratoires Traditionnellement, le séquençage après RT-PCR est la méthode de choix pour déterminer les mutations associées à la résistance. Le VIH, et les tests approuvés par la Food and Drug Administration ont été développés pour cette application Cette technologie est également couramment utilisée pour identifier les bactéries, les champignons et les mycobactéries sur la base des séquences dans le complexe du gène ribosomal Une fois la séquence d’un micro-organisme inconnu est déterminé, il peut être interrogé contre une génétique base de données qui contient des milliers de séquences Les résultats d’une requête sont renvoyés en pourcentage, ce qui aide le microbiologiste moléculaire à identifier les microorganismes. Cette approche est clairement prometteuse, et les produits commerciaux, par exemple, MicroSeq [Applied Biosystems] et bases de données par exemple, SmartGene ont été établies Le séquençage pleine longueur est particulièrement puissant lorsque plusieurs polymorphismes nucléotidiques sont nécessaires pour la caractérisation d’un microbe et ils sont éloignés les uns des autres dans l’amplicon, par exemple, certaines des mutations associées à la résistance au VIH. cette technologie comprendrait le coût de l’équipement, des réactifs et l’accès aux bases de données privées; le besoin d’analyser de longues longueurs d’ADN séquencé, ce qui demande du temps et du travail; L’autre type de séquençage d’ADN décrit plus récemment est le séquençage par synthèse ou pyroséquençage Cette technologie utilise des réactions chimiques exclusives, y compris plusieurs enzymes qui génèrent de la lumière quand un nucléotide est incorporé dans le brin d’ADN synthétisé. La quantité de cette lumière est proportionnelle au pyrophosphate libéré lors de l’incorporation des nucléotides. Par exemple, si les mêmes nucléotides sont incorporés, par exemple GG, la lumière générée sera le double de généré par l’incorporation d’un seul nucléotide, par exemple G L’instrument enregistre la distribution des nucléotides et les nucléotides générés par la lumière qui sont distribués mais non incorporés sont hydrolysés par l’apyrase, une des enzymes du mélange. il est synthétisé Les points forts de cette technologie sont qu’il est utilisateur amicale, les réactions se produisent dans la plaque bien utilisée, et les séquences immédiatement en aval de l’amorce de séquençage sont facilement déterminées, ce qui est idéal pour l’analyse SNP Les limites de cette approche comprennent le coût de l’instrumentation et des réactifs, sa capacité limitée à déterminer de manière appropriée la séquence d’homopolymères, c’est-à-dire, de nombreux nucléotides du même type se produisant l’un après l’autre, et la longueur de séquence d’ADN de haute qualité qui peut être générée, qui est & lt; NT et fréquemment est & lt; Comme noté, cette technologie est particulièrement utile pour l’analyse SNP, car l’évaluation d’un nombre limité de nucléotides est nécessaire. De plus, cette technologie, bien que peut-être moins discriminante que le séquençage Sanger, peut être utilisée dans la catégorisation taxinomique de microorganismes Pour cette application, il est nécessaire de déterminer la séquence des régions variables contenant des séquences uniques ou «signatures» pour les microorganismes au sein d’un groupe. Cette technologie a été utilisée pour catégoriser correctement les mycobactéries et les nocardiae en groupes cliniquement importants. Dans notre expérience à la Cleveland Clinic, cette technique d’identification des mycobactéries était moins coûteuse que notre approche traditionnelle qui utilisait des sondes génétiques et des réactions biochimiques non montrées. Elle a été utilisée pour identifier les levures, les champignons filamenteux et une variété de bactéries Il a également été utilisé pour différencier le virus du polyome BK et JC es, ainsi que les sous-types de VPH

Figure Vue largeDownload slidePyrogramme ie, tracé dérivé du pyroséquençage d’une région -bp qui a été utilisée pour l’identification des espèces de levure les plus courantes Les tailles des pics sont des mesures de la quantité de lumière générée, qui est corrélée à la quantité de pyrophosphate Généré lors de l’incorporation des nucléotides dans le processus de synthèse de l’ADN C parapsilose, Candida parapsilosisFigure Voir grandDownload slidePyrogramme ie, traçage issu du pyroséquençage d’une région -bp utilisée pour l’identification des espèces de levures les plus courantes Les tailles des pics sont des mesures de la quantité de lumière générée, qui est corrélée à la quantité de pyrophosphate générée lors de l’incorporation des nucléotides dans le processus de synthèse de l’ADN C parapsilose, Candida parapsilosis Indépendamment du type de technologie de séquençage utilisé, le clinicien effectuant le séquençage et le clinicien ordonnateur doivent être conscients des forces et des limites En outre, les identifications obtenues à l’aide de ces méthodes sont aussi fiables que les entrées dans les bases de données génétiques interrogées. Les entrées de bases de données génétiques doivent être basées sur des isolats qui ont été correctement identifiés par des méthodes traditionnelles si possible. Enfin, un nombre adéquat d’isolats bien identifiés de chaque espèce devrait être examiné, de sorte que la variation génétique normale puisse être comprise et incorporée dans le schéma d’identification, c.-à-d. qu’une variation puisse refléter seulement la variation de la souche. , tandis que d’autres variations sont significatives sur le plan taxonomique pour la différenciation des espèces L’essentiel est que l’identification séquentielle des microorganismes est seulement aussi bonne que les séquences de la bibliothèque génétique utilisée et la caractérisation des souches dont ces séquences sont dérivées. la technologie s’est avérée un outil important pour la discothèque very Ces plates-formes peuvent être utilisées pour tester simultanément plusieurs centaines de cibles et ont été un moyen critique d’étudier l’expression simultanée de plusieurs gènes. Cette technologie, quel que soit son format technique, consiste en de nombreuses hybridations sonde-cible individuelles réactions qui sont testées simultanément Sans surprise, cette technologie a été utilisée pour différencier de nombreux agents pathogènes microbiens, étudier leurs profils d’expression et détecter les déterminants génétiques de la pharmacorésistance Par exemple, peu de temps après son introduction, il a été démontré de différencier les mycobactéries médicalement importantes et de détecter les causes les plus communes de résistance aux médicaments antimycobactériens Malheureusement, les limites de cette technologie, telles que le coût, les réactions incohérentes dans certains systèmes et la gestion et l’interprétation des données, ont dépassé ses utilisations pratiques. point de vue pratique, simplement plus de données sont générées à partir d’un seul, larg Heureusement, cela change. L’un des domaines les plus prometteurs du diagnostic moléculaire est l’utilisation de puces à ADN limitées pour l’évaluation de nombreuses cibles génétiques après Une réaction multiplex ou un nombre PCRA large de différentes plates-formes de microarray ont été décrits, y compris des réseaux bioélectriques et des microarrays liquides. Comme avec toute technologie, il existe des avantages et des inconvénients pour chaque système. combinaisons de cibles, c.-à-d. qu’elles ont été rendues plus fiables et, peut-être plus importantes, certaines ont été réduites de grandes plates-formes à des versions plus petites qui traitent des problèmes cliniquement importants qui nécessitent des résultats multiples en microbiologie clinique. être suffisant pour traiter les causes les plus fréquentes de bactériémie et de fongémie, c.-à-d. les causes les plus fréquentes de résultats positifs de culture hématologique, et des tableaux de taille similaire pourraient être utilisés pour identifier les causes typiques des infections fongiques et mycobactériennes invasives. Cette approche est optimisée avec l’inclusion de larges sondes de famille ou de royaume Par exemple, une espèce Raoutella est un La présence d’une bactérie rare comme celle-ci dans l’échantillon d’hémoculture pourrait être détectée par l’inclusion d’un large éventail de bactéries. site de la sonde bactérienne sur le microréseau L’hybridation sur ce site, en l’absence d’hybridation sur un site déterminant l’espèce, démontrerait la présence d’une bactérie autre que l’une des causes les plus fréquentes de bactériémie incluses dans le panel.

Figure Vue largeDispositif microréseau bioélectrique limité ou à petite échelle démontrant la faisabilité de ce type de technologie pour différencier la plupart des mycobactéries cliniquement importantes Un site de genre Mycobacterium est situé de l’autre côté du microréseau, tandis que le reste est occupé par des espèces spécifiques ou Complexe spécifique Mycobacterium tuberculosis sites d’hybridation ITS, région de l’espaceur transcrit interneFigure View largeTélécharger une diapositive microréseau bioélectrique limitée ou à petite échelle démontrant la faisabilité de ce type de technologie pour différencier la plupart des mycobactéries cliniquement importantes Un site Mycobacterium genre est situé sur la far côté du microréseau, tandis que le reste est occupé par des sites d’hybridation du complexe Mycobacterium tuberculosis ITS, région d’espaceur transcrite interne. Il existe également des micro-essais spécifiques à la maladie, car ces formats peuvent être utilisés après PCR, multiplex PCR, ou une combinaison de tels essais Par exemple, on pourrait envisager un microréseau qui pourrait distinguer entre les diverses causes de méningoencéphalite Un tel test peut inclure une réaction multiplex complexe qui consistait en une PCR bactérienne à large spectre, un PCR spécifique à l’espèce pour Cryptococcus neoformans, une RT-PCR à large spectre pour les entérovirus et une PCR spécifique pour HSV Bien que non exhaustif, un tel panel devrait, dans un seul essai de postamplification, aborder tous les agents étiologiques les plus courants responsables de méningoencéphalite. Par exemple, un site du virus du Nil occidental pourrait être ajouté, si on le souhaite. Les microarrays limités, d’un point de vue commercial, représentent une technologie potentiellement perturbatrice, car leur utilisation répandue pourrait changer la façon dont nous Cependant, leur utilisation dépendra de nombreux facteurs, tels que le développement de produits utiles, le coût, la Food and Drug Administration En résumé, les méthodes moléculaires changent la façon dont nous pratiquons la médecine de laboratoire et affectent ainsi la pratique de la médecine clinique Nouvelles méthodes d’hybridation directe, rapide La PCR homogène en cycle, et une variété de méthodes d’analyse post-amplification rendent l’identification génétique et la caractérisation des microorganismes pathogènes plus rapides et, dans de nombreux cas, plus précis que jamais. Cependant, pour chacune de ces technologies, les ajouts à la santé les coûts des soins doivent être comparés aux avantages potentiels de diagnostics plus rapides Les techniques et les technologies sont ici Des études de résultats bien contrôlées sont maintenant nécessaires pour démontrer l’efficacité de ces technologies

Remerciements

Supplément de parrainage Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé “Conférence annuelle sur la résistance aux antimicrobiens”, parrainé par la Fondation nationale pour les maladies infectieuses Conflits d’intérêts potentiels GWP est un conseiller scientifique pour Luminex, AdvanDX, Roche, Cepheid, bioMerieux et BD GeneOhm et reçoit des redevances pour les licences de Biotage et BD GeneOhm